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本试剂盒以高纯度MTT作为指示剂，在经典操作步骤的基础上，采用独特的甲臜溶解液配方，可以直接溶解甲臜沉淀，无需去除原有的培养液。从而避免因去除培养液时甲臜被部分去除而引起的操作误差。具有本底低，灵敏度高，线性范围宽，操作简单等特点。另外，本试剂盒还提供配套的一次性针头过滤器和注射器，为实验带来更多的便利。

噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)，也称作溴化噻唑蓝四氮唑，是一种黄色染料，已经普遍替代传统的台盼蓝染色法或者放射性同位素插入法，用来检测细胞的活力，细胞增殖以及细胞毒性分析。检测原理在于：MTT是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原成为水不溶性的深蓝色MTT-甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。甲臜结晶是不能穿透细胞膜，因此沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。甲臜结晶可用DMSO或者酸化的异丙醇溶解出来，酶标仪下测定570nm的吸光度反映甲臜的生成量。而甲臜的生成量与活细胞数目成正比，用以评估细胞存活状况。

组分	500T	1000T	5000T
MTT粉末	25mg	50mg	250mg
MTT溶剂	5mL	10mL	50mL
甲臜溶解液	50mL	100mL	100mL×5
除菌套装	1包	1包	1包

保存：取出除菌套装室温保存，其他组分4℃保存，甲臜溶解液也可以放到室温保存，有效期1年。

• 甲臜溶解液具有腐蚀性和毒性，使用时注意防护。
  
• MTT有致癌性，应小心操作；MTT溶液需要无菌，因其对菌很敏感。MTT溶液不可4℃保存超过1周，因其可能发生降解，导致检测结果错误。
  
• MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度最好在0～0.7范围内。
  
• 使用微孔板进行检测，如果细胞培养时间比较长，需要注意蒸发的问题。一般情况，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，建议弃用周围一圈的方法，改加PBS，水或者细胞培养液等。也可通过将96孔板放在靠近培养箱内水源的位置，以减缓蒸发现象。
  
• 甲臜溶解液低温或者常温保存可能会产生沉淀，只需37℃水浴使其充分溶解，混匀后即可使用。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

本方法以96孔板为例。细胞生长的培养条件会影响检测效果，因此进行MTT检测时需考虑这些条件，包括：培养时间，传代次数以及生长培养基的成分等。一般情况，48-72h培养时间下，最初铺板的细胞密度可控制在5×10³～5×10⁴/100μL。也可根据细胞大小，增殖速度的快慢来优化最初的细胞铺板密度以及培养时间。
注意：

• 最终检测的培养液内含有酚红会严重影响检测结果。推荐MTT检测时细胞培养在无酚红环境下。也可以在进行MTT孵育的时候改用无酚红培养液。
  
• 每次实验都要设置空白对照孔(不含细胞)。对于细胞毒性试验，还要设置未经药物处理的细胞孔，此对照孔的吸光度范围一般控制在0.75～1.25之间；每个样品孔建议做三个平行。

• 实验前试剂准备
  
  • MTT溶液
    用5mL MTT溶剂直接溶解25mg MTT粉末配制成5mg/mL的工作液，用试剂盒内提供的除菌套装以除去溶液中的细菌，该溶液可4℃避光短时间保存(越短越好)。建议溶解后，直接将剩余液体小剂量分装放到-20℃保存，避免反复冻融，6个月稳定。
    
  • 甲臜溶解液(MTT终止液)
    甲臜溶解液低温或者常温保存可能会产生沉淀，只需37℃水浴使其充分溶解，混匀后即可使用。
• MTT细胞增殖检测
  
  • 接种细胞：用含10%胎牛血清(FBS)的培养液配制成单个细胞悬液，调整细胞密度，以每孔5×10³～5×10⁴个细胞接种到96孔板，每孔体积100μL，培养板的边缘孔用无菌PBS，水或者培养液填充。设置空白对照孔(不含有细胞)。
    
  • 37℃，5% CO₂，培养24-72h。
    
  • 可选：对于贴壁细胞，去除旧的培养液，更换100μL/孔新鲜的培养液(不含酚红)；对于悬浮细胞，离心96孔板，去除尽可能多的上清液。然后加入100μL/孔新鲜的培养液(不含酚红)重悬细胞；
    
  • 每孔加入10μL MTT工作液(5mg/mL)，加样时尽量勤换枪头，控制加量误差。
    
  • 水平摇床上低速混匀1min后，放入37℃培养箱孵育4h。注：对于高密度的细胞(>100,000 cells/孔)可缩短孵育时间至2h。
    
  • 对于贴壁细胞，直接吸掉旧的培养液，避免枪尖刮破单细胞层。对于悬浮细胞，离心收集细胞，去除培养液。
    
  • 加入100μL/孔甲臜溶解液，用枪充分混匀后放入37℃培养箱孵育4h。
    注：更长的孵育时间会降低检测灵敏度。
    
  • 孵育结束，放置在酶标仪上摇匀后，选择570nm，测定吸光度。记录结果，比色以空白调零。如果无570nm滤光片，可以使用560～600nm滤光片。
    注：对于细胞毒性检测，以未经药物处理细胞的OD值为100%，然后计算药物处理细胞所占的比率(x)，公式如下：OD(未处理细胞)/OD(药物处理细胞)=100%/x。然后建立直方图。

相关搜索：MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，MTT Cell Proliferation Assay Kit